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“Escherichia Colí productora de toxina Shiga (STEC)”, “E. coli enterohemorrágica (EHEC)” y “E. coli O157 ”a menudo se usan indistintamente cuando se discuten como amenazas para los establecimientos de alimentos. La pregunta es:

¿Son estos tres objetivos realmente iguales? La respuesta es complicada porque puede ser tanto sí como no.

Las cepas STEC se clasifican por dos características: su capacidad para producir verotoxinas o toxinas Shiga (stx) y su capacidad para adherirse a las membranas celulares.

Si bien hay varias variantes de stx, dos se han asociado como agentes causantes de enfermedades humanas: stx1 y stx2. Del mismo modo, STEC tiene múltiples formas de adherirse a las membranas celulares. La vía más común está asociada con un conjunto de genes, eae, que producen intimina, una adhesina de membrana externa esencial para la unión. No todas las cepas STEC contienen genes eae, como lo demuestra el brote de brotes de E. coli O104 STEC 2011 en Europa que causó 31 muertes. Esta cepa fue eae negativa y utilizó vías alternativas para la adhesión de la membrana. EHEC es un subconjunto de cepas STEC que pueden causar colitis hemorrágica (HC). El HC y las cepas que lo causan son una preocupación principal para los establecimientos de alimentos porque la enfermedad puede progresar a síndrome urémico hemolítico (SUH), una enfermedad potencialmente mortal.

Al hablar sobre EHEC y STEC, es importante recordar que todas las cepas de EHEC pueden considerarse cepas de STEC, pero no todas las cepas de STEC son cepas de EHEC, solo aquellas que causan HC. E. coli O157: H7 es el serogrupo principal asociado con el SUH. Una cepa de E. coli O157 que produce stx, se adhiere a las membranas celulares y causa HUS se clasificaría como STEC y EHEC. Una E. coli O157 no productora de toxinas no se consideraría ni una STEC ni una EHEC. Por lo tanto, la clasificación de estos tres términos sigue siendo abierta y garantiza que los establecimientos de alimentos tienen un fuerte conocimiento de cada uno.

Desafíos para la detección de STEC

E. coli O157 se ha considerado durante mucho tiempo un adulterante en los alimentos, y los métodos de detección se han utilizado en la industria alimentaria durante casi 20 años. Se estima que las cepas STEC causan más de 250,000 enfermedades anualmente, con alrededor de un tercio como resultado de O157. Pero hay muchas más cepas STEC que solo O157. Seis grupos adicionales (O26, O45, O103, O111, O121 y O145) han sido identificados como la fuente del 70 por ciento de las enfermedades no relacionadas con O157 y han sido identificados como adulterantes por el Departamento de Agricultura de los EE. UU. Servicio (USDA-FSIS). En junio de 2012, el USDA-FSIS implementó los requisitos para la expansión de las pruebas STEC en recortes de carne cruda, e hizo público un nuevo estándar de referencia para el análisis.

Estados Unidos no fue el único país que aumentó los requisitos de prueba. Como resultado del brote mortal de brotes, la Unión Europea (UE), en 2013, emitió nuevos criterios de pruebas microbiológicas para los brotes. Esas recomendaciones incluyeron pruebas adicionales para STEC. En los años posteriores, varios países de la UE también han aumentado las pruebas de cepas STEC en carne y productos lácteos. Todas las pruebas en la UE se realizarán utilizando el estándar de prueba ISO TS 13136 STEC. Si bien tanto el USDA-FSIS como la UE pusieron a disposición métodos para el análisis de STEC, estos métodos eran limitados, con pocas tecnologías rápidas disponibles comercialmente.

Las variantes de las cepas STEC están estrechamente relacionadas y a menudo pueden resultar difíciles de aislar para la detección. Las técnicas comunes empleadas por los laboratorios para resolver estos problemas a menudo no son prácticas. La suplementación de los medios con antibióticos se puede usar para seleccionar O157, pero el antibiótico recomendado para ayudar en la selección de O157, la novobiocina, puede inhibir completa o severamente el crecimiento de cepas STEC no O157.

Los métodos de detección basados ​​en la molecular, tradicionalmente los métodos de elección para O157, tendrían que diseñarse para detectar marcadores genéticos para múltiples objetivos, y aún así ser fáciles de usar. La creación de una solución completa de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) requiere la habilidad de analistas altamente capacitados. Además de detectar el serogrupo correcto, para que la cepa se considere adulterante, debería ser virulenta y capaz de adherirse a las membranas celulares.

Se requieren pruebas adicionales para confirmar la presencia de estos factores de virulencia (stx) y genes de adhesión (eae). Después de la presunta identificación, los laboratorios deben poder aislar la cepa objetivo. El aislamiento de los serogrupos usando perlas recubiertas de anticuerpos es sensible a la técnica, y la reactividad cruzada entre especies estrechamente relacionadas puede conducir a resultados inconsistentes.

Los medios utilizados para aislar las cepas a menudo carecen de selectividad efectiva o capacidad de diferenciación, lo que dificulta distinguir un serogrupo del siguiente. Estos métodos requieren analistas expertos para completar flujos de trabajo complejos y, a menudo, pueden requerir mucho trabajo y mucho tiempo. Existía una fuerte necesidad de mejorar los enfoques científicos y expandirse a nuevos métodos de detección y diferenciación.

Mejoras en detección

Desde la implementación de las regulaciones por el USDA-FSIS y la UE, se han producido avances en todas las fases del análisis de STEC, desde el enriquecimiento hasta la identificación. Estos cambios han simplificado los flujos de trabajo y aumentado la precisión de los datos que se generan.

La primera oportunidad de mejoras se produjo con el enriquecimiento de los analitos objetivo. Las modificaciones a las formulaciones de los medios de enriquecimiento junto con el enfoque en el uso de temperaturas elevadas y tiempos de incubación más cortos para enfatizar selectivamente el crecimiento de los organismos objetivo mientras se reduce el crecimiento de la microflora de fondo resultó en un mejor rendimiento de los métodos de detección rápida. Además de los medios de enriquecimiento más efectivos, se realizaron mejoras en la forma más común de detección, los kits de PCR molecular. A medida que aumentó la comprensión de los perfiles genómicos de estos organismos, los métodos moleculares se refinaron con objetivos nuevos y más específicos, aumentando la especificidad y selectividad de los ensayos.

Los kits de prueba listos para usar, con reactivos de amplificación premezclados (tanto en forma líquida como en gránulos), simplificaron un proceso molecular complejo. Los ensayos fueron diseñados para detectar múltiples secuencias de genes diana, buscando factores de virulencia y adhesión, y / o serotipos específicos. Sin embargo, no todos los problemas con los ensayos originales fueron resueltos. Debido a la cantidad de objetivos, no se ha desarrollado un solo ensayo de PCR para evaluar los factores de virulencia y cada serotipo.

En su lugar, se crearon conjuntos de sistemas, con un cribado de ensayo para los factores de virulencia y adhesión objetivo seguido de la detección de serogrupos específicos utilizando un segundo y / o tercer ensayo según sea necesario. Los kits multiplex se desarrollaron y validaron a partir de desarrolladores de métodos múltiples, lo que permite a los laboratorios integrar sin problemas el análisis en sus sistemas actuales.

Paralelamente a los avances en la detección de estos organismos, se realizaron mejoras en el proceso de aislamiento. Los anticuerpos utilizados para el aislamiento de organismos continúan siendo modificados para reducir la reactividad cruzada y reducir la microflora de fondo en placas de agar. Se han incluido combinaciones de cromógenos, antibióticos y otros factores de crecimiento en las nuevas formulaciones de agar, mejorando su capacidad no solo para seleccionar las cepas objetivo sino también para permitir una discriminación más fácil entre los siete serogrupos principales. Amplios rangos de morfologías de color de colonias facilitan la identificación de los serogrupos en comparación con el discernimiento de tonos de un solo color (púrpura, azul púrpura, rojo púrpura, etc.). Múltiples enfoques ahora están disponibles para el aislamiento, que van desde el uso de un solo agar que permite la diferenciación entre los siete serogrupos hasta el uso de múltiples agars que se dirigen a serogrupos únicos. Ambos enfoques proporcionan ventajas y desventajas para el usuario final. El ahorro de costos para un solo agar puede compensarse con la habilidad requerida para discernir entre las morfologías de las colonias. Se pueden obtener costos laborales reducidos en la identificación de cepas con el uso de agar múltiple, pero los costos de material pueden aumentar. En última instancia, estas mejoras de forma aislada permiten a los usuarios finales una mayor flexibilidad en la elección que mejor se adapte a sus necesidades.

Desde el mandato de realizar pruebas adicionales, se han realizado mejoras. Se están empleando ensayos listos para usar en los laboratorios de todo el mundo, y el aislamiento de aislados positivos presuntos es más fácil que nunca. Incluso con estas mejoras, sin embargo, todavía existen problemas. El uso de kits de prueba múltiples no garantiza que una muestra presuntamente positiva contenga una cepa STEC. Por ejemplo, una muestra enriquecida puede contener uno de los siete serogrupos principales que no es virulento. Esa muestra también puede contener cepas de E. coli que tienen genes stx o eae. Los kits de prueba no pueden discernir entre múltiples aislamientos y requieren un trabajo cultural adicional para confirmar la presencia de un verdadero STEC. Este proceso de detección y aislamiento puede ser largo y costoso y ha llevado a los establecimientos de alimentos a buscar tecnologías alternativas.

Próximos pasos en la detección

El objetivo final para muchos en la industria alimentaria es un método diseñado para detectar los siete serogrupos principales que contienen factores virulentos y de adhesión en un kit de prueba único, fácil de usar y asequible.

La última media década ha acercado esto a la realidad con la implementación de tecnologías de secuenciación genética como la secuenciación de próxima generación (NGS) y la secuenciación del genoma completo (WGS) en más y más laboratorios. Las huellas reducidas, los flujos de trabajo simplificados y las bases de datos mejoradas han aumentado la adopción de NGS / WGS. Estas tecnologías ofrecen la capacidad de detectar serotipos, virulencia y otros factores genéticos basados ​​en los perfiles producidos.

Los avances en WGS han resultado en su implementación para el uso de detección e investigación de brotes debido a su capacidad de proporcionar un nivel avanzado de discriminación de tensión en días versus semanas.

Los desarrolladores de métodos continúan explorando y expandiendo las posibilidades de secuenciación combinándola con otros tipos de tecnología. El uso de la detección basada en PCR, seguida de WGS, combina las ventajas de ambas tecnologías, lo que permite una detección rápida y luego una mayor discriminación de los aislados. Sin embargo, NGS y WGS no están exentos de sus propios desafíos. La industria alimentaria ha tardado en adoptar WGS.

¿Hacia dónde nos dirigimos?

Con nuevos mandatos para realizar pruebas por parte del USDA-FSIS y la UE, la tecnología para detectar y diferenciar STEC ha progresado rápidamente.

Existen ventajas y desventajas tanto con las metodologías de uso común como con las que ganan tracción. Si bien el desarrollo continuo de tecnologías nuevas y novedosas puede hacer que las tecnologías de hoy parezcan arcaicas, traen sus propios inconvenientes. Los laboratorios no son de talla única, y la necesidad de múltiples opciones es vital. Un enfoque amplio para mejorar nuestros métodos actuales, así como investigar nuevas técnicas novedosas, es importante para la industria alimentaria.

Patrick Bird, M.Sc., is the owner of PMB BioTek Consulting and a technical consultant with AOAC.